SABIT

Beranda
Instrumen Kimia

HPLC: Mending Pisahin Molekul atau orang Berantem?

Analisis kimia memegang peranan penting dalam berbagai bidang, mulai dari penelitian ilmiah hingga pengendalian kualitas di industri. Di dunia farmasi, analisis kimia memastikan obat-obatan aman dan efektif. Dalam sektor lingkungan, metode analisis membantu memantau dan mengontrol polusi. Sementara itu, di industri makanan dan minuman, analisis digunakan untuk menjamin keamanan dan kualitas produk. Dengan kebutuhan yang semakin meningkat untuk analisis yang akurat, cepat, dan efisien, teknologi seperti High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) menjadi semakin relevan.



Apa Itu HPLC?

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC), atau Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), adalah metode analisis yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan menentukan jumlah komponen dalam campuran. Dengan prinsip dasar pemisahan berdasarkan interaksi molekul dengan fase diam dan fase gerak, HPLC memungkinkan analisis yang sangat presisi. Teknologi ini menjadi pilihan utama karena mampu menganalisis sampel dalam konsentrasi rendah dan dalam waktu yang relatif singkat.


Perbedaan HPLC, GC, dan TLC

HPLC, Gas Chromatography (GC), dan Thin Layer Chromatography (TLC) adalah teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dalam sampel, namun masing-masing memiliki prinsip dan aplikasi yang berbeda. HPLC menggunakan fase gerak cair yang dialirkan melalui kolom berisi fase diam, di mana pemisahan terjadi berdasarkan interaksi molekul dengan fase tersebut. Teknik ini cocok untuk sampel yang tidak dapat diuapkan, seperti senyawa polar dan non-polar dalam bentuk cair, serta memiliki resolusi dan sensitivitas tinggi. Sementara itu, GC menggunakan fase gerak gas dan lebih cocok untuk sampel yang volatil atau dapat diuapkan, seperti gas, alkohol, dan hidrokarbon. GC biasanya lebih cepat dibandingkan HPLC dan memiliki sensitivitas tinggi, tetapi terbatas pada senyawa yang volatil. Di sisi lain, TLC adalah teknik yang paling sederhana dan murah, menggunakan lapisan tipis fase diam dan fase gerak cair untuk memisahkan sampel. Meskipun resolusinya lebih rendah, TLC sering digunakan untuk analisis kualitatif dan pemantauan reaksi kimia, serta cocok untuk sampel dalam jumlah kecil. HPLC lebih kompleks dan memerlukan peralatan mahal, sedangkan GC lebih murah dan cepat, dan TLC cocok untuk keperluan laboratorium yang lebih sederhana.


Konsep Pemisahan Molekul Berdasarkan Interaksi dengan Fase Diam dan Fase Gerak

Pemisahan dalam HPLC dapat dijelaskan dengan konsep afinitas dan kepolaran yang berkaitan dengan bagaimana molekul sampel berinteraksi dengan fase diam dan fase gerak. Interaksi ini menentukan seberapa cepat atau lambat molekul bergerak melalui kolom, yang pada gilirannya menyebabkan pemisahan komponen-komponen dalam sampel.

Afinitas Molekul

Afinitas merujuk pada kecenderungan molekul untuk berinteraksi dengan fase diam atau fase gerak dalam sistem HPLC. Afinitas ini dipengaruhi oleh sifat kimiawi dan fisik molekul, seperti polaritas, ukuran, dan muatan molekul tersebut.

  1. Molekul dengan Afinitas Tinggi terhadap Fase Diam: Molekul yang memiliki afinitas tinggi terhadap fase diam akan lebih banyak berinteraksi dengan material di dalam kolom, seperti partikel silika atau bahan lain yang membentuk fase diam. Molekul-molekul ini akan mengalami penundaan lebih lama dalam kolom karena gaya tarik menarik antara molekul dan fase diam (seperti gaya van der Waals, ikatan hidrogen, atau interaksi ionik). Sebagai hasilnya, molekul ini akan bergerak lebih lambat melalui kolom.

  2. Molekul dengan Afinitas Rendah terhadap Fase Diam: Sebaliknya, molekul yang memiliki afinitas rendah terhadap fase diam cenderung tidak berinteraksi terlalu banyak dengan fase diam. Oleh karena itu, molekul ini akan bergerak lebih cepat melalui kolom, didorong oleh fase gerak (pelarut).

Dengan cara ini, komponen-komponen dalam sampel dapat dipisahkan berdasarkan perbedaan afinitas mereka terhadap fase diam dan fase gerak.

Kepolaran Molekul

Kepolaran merujuk pada distribusi muatan dalam molekul yang menyebabkan adanya kutub positif dan negatif. Molekul yang polar memiliki daerah yang bermuatan positif dan negatif, sedangkan molekul non-polar cenderung memiliki distribusi muatan yang lebih merata.

  1. Molekul Polar: Molekul polar cenderung berinteraksi lebih kuat dengan fase diam yang juga polar (seperti kolom berbasis silika gel yang memiliki gugus polar). Interaksi ini memperlambat pergerakan molekul polar melalui kolom, karena gaya tarik antara molekul dan fase diam akan lebih kuat. Molekul polar juga akan lebih larut dalam pelarut polar, tetapi interaksinya dengan fase diam yang lebih kuat akan memperlambat migrasinya.

  2. Molekul Non-Polar: Molekul non-polar, di sisi lain, lebih cenderung berinteraksi dengan fase gerak yang non-polar. Karena fase diam sering kali lebih polar (terutama dalam kolom berbasis silika), molekul non-polar akan bergerak lebih cepat karena mereka tidak terlalu terikat pada fase diam. Molekul non-polar akan lebih efisien bergerak melalui kolom jika fase gerak yang digunakan juga non-polar, karena tidak ada interaksi kuat antara molekul dan fase diam.

Interaksi antara Afinitas dan Kepolaran

Afinitas molekul terhadap fase diam dan fase gerak sangat bergantung pada kepolaran molekul tersebut. Sebagai contoh:

  • Fase Diam Polar + Fase Gerak Polar
    Molekul polar dalam sampel akan berinteraksi lebih kuat dengan fase diam polar, menyebabkan pemisahan yang lebih baik antara molekul-molekul polar dan non-polar. Molekul non-polar akan bergerak lebih cepat karena interaksi mereka dengan fase diam lebih lemah.

  • Fase Diam Non-Polar + Fase Gerak Non-Polar
    Jika fase diam dan fase gerak sama-sama non-polar, molekul non-polar dalam sampel akan lebih mudah bergerak karena interaksi mereka dengan fase diam sangat lemah, sedangkan molekul polar akan bergerak lebih lambat karena mereka akan lebih banyak berinteraksi dengan fase diam.

Pemisahan dalam HPLC sangat bergantung pada bagaimana molekul dalam sampel berinteraksi dengan fase diam dan fase gerak. Molekul-molekul yang memiliki afinitas lebih tinggi terhadap fase diam akan bergerak lebih lambat, sementara molekul dengan afinitas rendah akan bergerak lebih cepat. Begitu juga, kepolaran molekul memainkan peran besar dalam menentukan seberapa kuat atau lemah interaksi dengan fase diam dan fase gerak, yang akhirnya mengarah pada pemisahan komponen dalam sampel.

Tentu, berikut adalah penjelasan dengan urutan yang telah diperbarui, menempatkan Reservoir Pelarut pada urutan pertama:


Komponen Utama dalam HPLC


Sistem High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) terdiri dari beberapa komponen utama yang bekerja bersama untuk melakukan pemisahan, deteksi, dan analisis sampel.

1. Reservoir Pelarut (Solvent Reservoir)

Reservoir pelarut adalah wadah yang menyimpan pelarut atau campuran pelarut yang digunakan sebagai fase gerak dalam sistem HPLC. Fase gerak ini akan mengalir melalui kolom untuk membawa sampel dan memisahkan komponen-komponennya. Pelarut yang umum digunakan dalam HPLC termasuk air, metanol, asetonitril, etanol, dan campuran pelarut polar dan non-polar.

2. Pompa (Pump)

Fungsi utama pompa adalah untuk mengalirkan fase gerak (pelarut atau campuran pelarut) ke dalam kolom dengan tekanan yang sangat tinggi. Pompa memastikan aliran fase gerak yang stabil dan konstan, yang penting untuk mempertahankan ketepatan pemisahan dalam kolom.

  • Jenis Pompa:

    • Pompa Isokratik: Menggunakan satu jenis pelarut atau campuran pelarut yang tetap sepanjang analisis.
    • Pompa Gradien: Mengubah komposisi pelarut selama proses kromatografi, memungkinkan pemisahan yang lebih baik untuk sampel dengan berbagai jenis komponen.

  • Tekanan:
    Pompa HPLC mampu menghasilkan tekanan yang sangat tinggi, biasanya antara 1000 hingga 6000 psi, tergantung pada jenis kolom yang digunakan.

3. Injektor (Injector)

Injektor berfungsi untuk memasukkan sampel ke dalam sistem HPLC. Sampel, yang biasanya berupa cairan, diinjeksikan ke dalam aliran fase gerak dengan volume yang sangat kecil dan tepat, sehingga pemisahan komponen dalam sampel dapat dilakukan dengan akurat.

  • Injektor Manual: Pengguna menginjeksi sampel dengan cara manual, sering digunakan untuk analisis dengan volume kecil.
  • Injektor Otomatis: Dioperasikan oleh perangkat lunak komputer dan dapat menangani injeksi sampel secara otomatis, sangat berguna untuk analisis berulang.

4. Kolom (Column)

Kolom adalah bagian terpenting dalam HPLC karena pemisahan komponen sampel terjadi di dalam kolom ini. Kolom berisi fase diam (biasanya material seperti silika gel atau bahan polimer), yang memisahkan molekul dalam sampel berdasarkan interaksi mereka dengan fase diam dan fase gerak.

  • Jenis Kolom:

    • Kolom Normal Phase: Menggunakan fase diam yang polar dan fase gerak yang non-polar.
    • Kolom Reverse Phase: Menggunakan fase diam yang non-polar dan fase gerak yang polar. Ini adalah jenis kolom yang paling umum digunakan karena kemampuannya memisahkan banyak jenis senyawa organik.

  • Ukuran Kolom:
    Kolom HPLC bervariasi dalam panjang dan diameter, tergantung pada aplikasi analisis. Umumnya, panjang kolom adalah antara 30 cm hingga 50 cm, dan diameternya sekitar 4,6 mm, dengan ukuran partikel fase diam sekitar 3 hingga 5 mikron.

5. Detektor (Detector)

Detektor digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen yang terpisah setelah mereka keluar dari kolom. Detektor ini akan mengukur sinyal yang dihasilkan oleh interaksi antara komponen dengan fase gerak atau fase diam, yang kemudian digunakan untuk menghasilkan kromatogram.

  • Jenis Detektor:
    • UV-Vis (Ultraviolet-Visible): Mengukur absorbansi cahaya pada panjang gelombang tertentu. Banyak digunakan untuk senyawa yang menyerap UV atau cahaya tampak.
    • Fluorescence Detector: Mengukur intensitas fluoresens dari senyawa yang dapat berfluoresensi saat diterpa cahaya.
    • Refractive Index Detector (RI): Mengukur perubahan indeks bias pelarut saat melewati senyawa yang terdeteksi.
    • Conductivity Detector: Digunakan untuk mendeteksi senyawa yang dapat menghantarkan listrik.
    • Mass Spectrometer (MS): Beberapa sistem HPLC dilengkapi dengan detektor MS untuk analisis lebih lanjut mengenai massa dan struktur molekul.

6. Pengumpul Fraksi (Fraction Collector)

Pengumpul fraksi digunakan dalam HPLC preparatif, di mana sampel yang telah dipisahkan dikumpulkan dalam fraksi individu untuk analisis lebih lanjut atau penggunaan lainnya. Pengumpul fraksi dapat mengumpulkan senyawa yang terpisah berdasarkan waktu retensinya.

7. Sistem Kontrol dan Komputer (Data System and Software)

Komputer dan perangkat lunak kontrol digunakan untuk mengatur dan memantau seluruh proses HPLC. Perangkat ini mengontrol aliran fase gerak, injeksi sampel, dan pengaturan detektor. Selain itu, perangkat lunak ini juga digunakan untuk menganalisis data dan menghasilkan kromatogram, yang menggambarkan pemisahan komponen dalam sampel berdasarkan waktu retensi dan intensitas deteksi.

  • Fungsi Komputer:
    • Mencatat dan memproses data dari detektor.
    • Menganalisis kromatogram untuk identifikasi dan kuantifikasi komponen.
    • Menyediakan kontrol otomatis untuk seluruh sistem HPLC, termasuk pompa, injektor, dan detektor.

Sistem HPLC terdiri dari beberapa komponen yang bekerja secara sinergis untuk melakukan pemisahan dan analisis sampel dengan akurasi tinggi. Setiap komponen memiliki peran penting, mulai dari reservoir pelarut yang menyediakan fase gerak, pompa yang mengalirkannya ke kolom, injektor yang memasukkan sampel, kolom yang memisahkan komponen, detektor yang mendeteksi komponen yang terpisah, hingga komputer yang mengontrol dan menganalisis data. Reservoir pelarut berperan sebagai penyedia pelarut utama yang mendukung aliran fase gerak, baik dalam sistem isokratik maupun gradien.


Alur Kerja HPLC

Proses HPLC terdiri dari beberapa tahapan yang terjadi secara berurutan. Berikut adalah langkah-langkah dalam alur kerja HPLC:

1. Persiapan Sampel

  • Sampel yang akan dianalisis biasanya diolah terlebih dahulu untuk memastikan bahwa ia dalam bentuk yang dapat dianalisis. Misalnya, sampel harus dalam bentuk larutan atau ekstrak yang sesuai dengan jenis detektor yang digunakan.
  • Jika diperlukan, sampel juga dapat difilter atau disaring untuk menghilangkan partikel yang dapat merusak kolom atau mengganggu hasil analisis.

2. Pemilihan dan Persiapan Fase Gerak (Mobile Phase)

  • Fase gerak (mobile phase) dalam HPLC berupa cairan yang digunakan untuk membawa sampel melalui kolom kromatografi. Fase gerak ini terdiri dari satu atau lebih pelarut cair yang disesuaikan dengan sifat kimia sampel yang akan dianalisis.
  • Beberapa contoh fase gerak cair yang umum digunakan dalam HPLC adalah:
    • Air: Sering digunakan dalam analisis senyawa yang larut dalam air atau polar.
    • Asetonitril (ACN): Pelarut organik yang sering digunakan untuk menganalisis senyawa non-polar atau sedikit polar.
    • Metanol (MeOH): Digunakan untuk senyawa yang larut baik dalam air maupun pelarut organik.
    • Campuran pelarut: Campuran air dan pelarut organik seperti asetronitril atau metanol, yang disesuaikan untuk mencapai keseimbangan kepolaran yang optimal.
    • Pelarut non-aqueous: Digunakan dalam analisis senyawa lipofilik (hidrofobik), seperti etil asetat atau diklorometana.
  • Fase gerak perlu disiapkan dalam kondisi yang stabil dan konsisten untuk memastikan akurasi dalam pemisahan komponen sampel.

3. Pengisian Kolom

  • Kolom kromatografi diisi dengan fase diam, yang sering kali terdiri dari partikel silikon dioksida yang memiliki sifat adsorpsi.
  • Kolom ini bertugas untuk memisahkan komponen-komponen dalam sampel berdasarkan interaksi mereka dengan fase diam.

4. Pengaturan Aliran Fase Gerak

  • Fase gerak dipompa melalui kolom dengan tekanan tinggi menggunakan pompa HPLC.
  • Kecepatan aliran fase gerak diatur agar sesuai dengan kondisi yang dibutuhkan untuk pemisahan yang optimal. Biasanya, pengaturan ini berhubungan dengan ukuran kolom dan viskositas fase gerak.

5. Injeksi Sampel

  • Sampel yang telah disiapkan diinjeksikan ke dalam aliran fase gerak menggunakan injektor otomatis atau manual.
  • Sampel akan langsung masuk ke dalam kolom dan mulai dipisahkan berdasarkan interaksi dengan fase diam.

6. Proses Pemisahan di Kolom

  • Ketika sampel melewati kolom, komponen-komponen dalam sampel akan berinteraksi secara berbeda dengan fase diam.
  • Komponen yang lebih kuat berinteraksi dengan fase diam akan bergerak lebih lambat, sementara komponen yang kurang berinteraksi akan bergerak lebih cepat.
  • Hasilnya, komponen-komponen dalam sampel akan terpisah dalam waktu yang berbeda, yang menghasilkan puncak-puncak terpisah pada detektor.

7. Deteksi

  • Setelah sampel terpisah, detektor HPLC (misalnya UV-Vis, fluoresensi, atau detektor massa) mendeteksi setiap komponen berdasarkan sifat-sifat tertentu (misalnya absorbansi pada panjang gelombang tertentu untuk detektor UV-Vis).
  • Data hasil deteksi dikirimkan ke sistem pengolahan data untuk dianalisis.

8. Analisis Data

  • Data yang diperoleh dari detektor akan menghasilkan puncak pada kromatogram. Masing-masing puncak mewakili salah satu komponen dalam sampel.
  • Waktu retensi (retention time) dan area puncak digunakan untuk mengidentifikasi dan kuantifikasi komponen-komponen tersebut.

9. Pencatatan Hasil

  • Hasil analisis dapat disajikan dalam bentuk laporan yang mencakup identifikasi dan kuantifikasi komponen sampel berdasarkan kromatogram yang diperoleh.
  • Biasanya, hasil ini akan dibandingkan dengan standar atau data referensi untuk memastikan keakuratan hasilnya.

Setiap langkah dalam alur kerja ini sangat penting untuk memastikan hasil yang akurat dan dapat diandalkan dalam analisis menggunakan HPLC. Pemilihan fase gerak yang tepat, misalnya, berperan besar dalam kualitas pemisahan dan analisis yang optimal.


Aplikasi HPLC

HPLC memiliki berbagai aplikasi di banyak bidang karena kemampuannya untuk memisahkan dan menganalisis berbagai jenis senyawa dengan akurasi tinggi. Beberapa aplikasi HPLC antara lain:

  1. Analisis Obat-Obatan
    HPLC banyak digunakan dalam industri farmasi untuk analisis kuantitatif dan kualitatif obat-obatan. Teknik ini digunakan untuk memastikan kemurnian obat, mengidentifikasi kandungan aktif, serta menguji stabilitas dan konsentrasi bahan dalam sediaan obat.

  2. Penyelidikan Senyawa Kimia
    Dalam penelitian kimia dan kimia analitik, HPLC digunakan untuk memisahkan senyawa organik, seperti alkaloid, flavonoid, dan pestisida dalam sampel yang kompleks, termasuk sampel lingkungan dan makanan.

  3. Penganalisis Komponen Biologis
    HPLC digunakan untuk menganalisis protein, asam nukleat (DNA/RNA), peptida, dan asam amino. Teknik ini sangat berguna dalam bioteknologi, analisis biologis, dan penelitian farmasi, untuk pemurnian protein atau identifikasi biomolekul.

  4. Kontrol Kualitas di Industri Makanan dan Minuman
    Di industri makanan, HPLC digunakan untuk menguji kadar gula, asam, vitamin, pestisida, dan aditif dalam produk makanan. Hal ini penting untuk memastikan bahwa produk memenuhi standar keamanan dan kualitas yang ditetapkan.

  5. Analisis Lingkungan
    HPLC digunakan dalam pengujian pencemaran air, udara, dan tanah. Teknik ini efektif dalam mengidentifikasi dan mengukur senyawa berbahaya seperti logam berat, pestisida, dan senyawa organik volatil yang dapat mencemari lingkungan.

  6. Forensik dan Kriminalistik
    Dalam ilmu forensik, HPLC digunakan untuk mengidentifikasi senyawa dalam sampel biologis, seperti darah atau urin, guna mendeteksi obat-obatan terlarang, alkohol, atau bahan kimia toksik lainnya yang mungkin terlibat dalam kejahatan atau kecelakaan.

  7. Analisis Minyak dan Produk Kimia
    Dalam industri minyak dan gas, HPLC digunakan untuk menganalisis senyawa-senyawa yang terdapat dalam produk minyak, seperti hidrokarbon, serta untuk pengujian aditif atau kontaminan dalam produk kimia.


Mending Pisahin Molekul atau orang Berantem?

Tentu saja, memisahkan molekul dengan HPLC jauh lebih mudah dan lebih menyenangkan dibandingkan dengan memisahkan orang yang berantem.

Di HPLC, pemisahan molekul dilakukan dengan menggunakan prinsip fisikokimia yang sudah terstandarisasi, hanya perlu memilih fase gerak dan fase diam yang tepat, atur kecepatan aliran, dan voila! Molekul yang berbeda akan "berpisah" dengan rapi sesuai sifat kimianya.

Sementara, memisahkan orang yang berantem… itu lebih rumit. Dibutuhkan keterampilan diplomasi, kesabaran ekstra, dan kadang-kadang bisa jauh lebih lama daripada sekadar menunggu molekul terpisah di kolom HPLC! 

Jadi, kalau mau memisahkan sesuatu, lebih baik molekul, kan?

Refrensi

Bansal, V.K. (2010). HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY: A SHORT REVIEW. Journal of Global Pharma Technology, 2.

Mumtaz, S.M., Ahmad, M., & Kumar, Y. (2018). HPLC: Principle and Maintenance with Application. International Journal of Trend in Scientific Research and Development.

Chawla, G., & Chaudhary, K.K. (2019). A review of HPLC technique covering its pharmaceutical, environmental, forensic, clinical and other applications. International Journal of Pharmaceutical Chemistry and Analysis.

Lets Fly Higher!